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| Connaissant maintenant quelques caractéristiques de l'apoptose, nous pouvons envisager de tenter la détection de celle-ci. Selon la préparation cellulaire ou tissulaire dans laquelle nous désirons détecter la présence ou l'absence d'apoptose, l'information recherchée, le nombre d'échantillons à analyser et les frais engendrés, plusieurs méthodes s'offrent à nous. Voici donc quelques exemples pour détecter la présence ou l'absence d'apoptose dans différentes préparations tissulaires ou cellulaires. |
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Caractéristique
visée
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Technique
et préparation utilisées
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Morphologie
cellulaire
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Un marquage avec un fluorochrome, le DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) qui se fixe spécifiquement à l'ADN. Un bourgeonnement de la membrane plasmique et la présence de corps apoptotiques peuvent être observés grâce à ce fluorochrome.
Dans une préparation cellulaire |
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Fragmentation
de l'ADN
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La fragmentation de l'ADN est causée par les endonucléases induites durant le processus apoptotique. La coupure de l'ADN se produit préférentiellement dans une région spécifique de l'ADN, ce qui provoque la libération de fragments oligonucléosomaux typiques de l'apoptose de 180-200 paires de bases. Ces fragments peuvent être visualisés sur un gel d'agarose sous forme de bandes multiples formant une "échelle d'ADN" (DNA ladder).
Dans la ligne 1, on retrouve un marqueur de poids moléculaire; dans la ligne 2, on retrouve des cellules U937 sans stimulus apoptotique; dans la ligne 3 des cellules U937 avec un stimulus apoptotique et dans la ligne 4 on retrouve un contrôle positif. Source "Roche Diagnostics". La coupure d'ADN durant l'apoptose peut produire plusieurs types de fragments d'ADN: à double ou simple brin ou de faible poids moléculaire. Ces fragments peuvent être identifiés par un marquage des extrémités 3'-OH grâce à des nucléotides modifiés et l'utilisation de réactions enzymatiques. Deux méthodes existent: la première utilise la DNA polymérase qui permet l'incorporation des nucléotides marqués aux sites de coupures d'ADN; la seconde est l'utilisation de la "terminal transferase" (TdT) qui incorpore les nucléotides marqués aux sites de coupures d'ADN ainsi qu'aux extrémités 3'-OH des fragments d'ADN.
Double marquage de moëlle épinière de rats (TdT combinée à l'iodure de propidium qui se lie spécifiquement aux double brins d'acides nucléiques). Source "Roche Diagnostics". |
| Activation des protéases |
Les caspases sont des enzymes qui coupent les protéines au niveau des résidus acide aspartique. Les caspases peuvent être séparées en 2 groupes: les caspases initiatrices qui possèdent un long pro-domaine qui leur permet de s'autoactiver en intéragissant avec les molécules activatrices et les caspases exécutrices qui ont un court pro-domaine. L'identification des protéines présentes dans une préparation cellulaire ou tissulaire selon leur poids moléculaire peut se faire à l'aide d'une technique appelée "western blot".
Analyse par "western blot" du précurseur de caspase-3 dans des "lysats" de cellules de A) Jurkat B) HUT 78 C) CCRF-HSB-2. Source "Santa Cruz Laboratory" |
