Personne ne peut le nier : parmi toutes les découvertes récentes, les manipulations génétiques sont de loin le sujet le plus d'actualité. Et le plus controversé. On entend sans cesse parler de chercheurs qui ont mis au point, par exemple, une nouvelle sorte de plante par l'intermédiaire de manipulations génétiques. On promet de meilleures récoltes. On vente les mérites du clonage. On convainc les gens des bienfaits des OGM. Et on cherche même à modifier notre propre génome. Mais qu'en est-il réellement ? Où sommes-nous rendu ? Pourquoi ne pas se contenter de ce que la nature nous a offert ? Pourquoi les compagnies pharmaceutiques dépensent-elles annuellement plusieurs centaines de millions de dollars pour des recherches dans ce domaine ? Pourquoi continue-t-on d'essayer alors que les échecs s'empilent les uns par-dessus les autres ?
Le présent document cherche à répondre à ces questions d'ordre technique. Il fait un bref survol des principales méthodes actuellement en pratique. Il présente également les motivations à long terme qui nous poussent à persévérer ainsi que les quelques succès qui nous encourage à continuer.
Bien que les manipulations génétiques soulève d'énormes questions, surtout d'ordre éthique, ce document ne s'y attarde pas. Il se contente de présenter objectivement les faits en laissant aux comités d'éthique le plaisir de débattre contre l'évolution de la science.
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Document produit par :
Pier-Yves Trépanier
dans le cadre du cours collégial Évolution et Diversité du Vivant
Décembre 2001 |
La thérapie génique vise la modification du matériel génétique d'un individu dans un but thérapeutique. Le principe est simple : remplacer un gène déficient ou défectueux par un gène normal ou encore ajouter une séquence qui comblera le manque ou les dommages occasionnés par un ou des allèles malsains. On parle ici de rôle curateur. Dans un avenir rapproché, on espère également prévenir une maladie génétique avant même la manifestation des premiers symptômes. On parlera alors de rôle préventif.
L'idée paraît enfantine mais l'application s'avère beaucoup plus complexe. Avant de commencer à effectuer quelques traitements que ce soit, il faut se demander si la maladie est accessible ou non à la thérapie génique. Il faut également connaître les gènes responsables de la maladie. Pour ce faire, on réalise un séquençage de l'ADN ( étude des nucléotides qui la composent ), ce qui permettra de cibler la zone responsable de la pathologie. Il faut ensuite synthétiser le gène curateur et l'incorporer dans un vecteur. Puis, il faut sélectionner les cellules qui permettront l'entrée du gène, y introduire le gène en question et, dans le cas d'un vecteur artificiel, éviter que ce dernier ne soit détruit par les lysosomes. Finalement, il faut s'arranger pour que le gène s'exprime au bon endroit de façon permanente tout en évitant les effets secondaires néfastes.
L'idée d'une telle thérapie est née il y a une trentaine d'années. À cette époque, on espérait uniquement guérir les maladies d'ordre génétiques; c'est-à-dire celles provoquées par un segment d'ADN mal fonctionnel. Aujourd'hui, on entrevoit la possibilité d'utiliser la thérapie génique dans plusieurs domaines de la médecine moderne telles les transplantations, la guérison de maladies infectieuses et même pour traiter le cancer. Cette seconde vocation consiste en l'introduction d'un gène exogène dont l'activité sera bénéfique pour le traitement de la maladie.
À l'heure actuelle, il existe au moins deux approches différentes pour pratiquer la thérapie génique. La thérapie génique ex vivo consiste à prélever des cellules malades, à les cultiver hors de l'organisme avant d'y faire pénétrer le transgène, puis à les y réintroduire. Cette technique permet de contrôler l'étape de traduction et ainsi de s'assurer du bon fonctionnement des cellules modifiées avant la réadministration au patient. La thérapie génique in vivo, pour sa part, consiste à introduire le transgène à même le patient directement dans les cellules malades. Cette méthode est un peu plus simple mais elle expose directement l'organisme aux risques du vecteur, surtout s'il est d'origine virale.
Guérison de deux « enfants-bulle » ( 29 avril 2000 )
Une équipe de chercheurs français a permis à des bébés souffrant d'une grave maladie génétique de quitter le milieu stérile dans lequel ils étaient confinés. On traitait habituellement ce déficit immunitaire par la greffe de moelle provenant de donneurs sains ( et compatibles ) sur une base régulière. Hors, au moment d'écrire l'article, deux des enfants traités vivaient sans traitement depuis un an et ce, à l'extérieur de leur " bulle " protectrice.
La maladie est causée par un allèle récessif situé sur le chromosome X. Les cellules sanguines spécialisées dans la lutte contre les infections, les lymphocytes T et les cellules tueuses NK, sont inexistantes. Étant donné l'absence totale de cellules défensives, toutes infections, aussi légères soient-elles, mettent la vie de l'enfant en péril. Sur le plan clinique, seul les garçons sont affectés.
Pour en arriver à un tel succès, des cellules de la moelle osseuse du patient ont été prélevées. Puis, les cellules qui habituellement produisent les lymphocytes T et NK ont été isolées. Ensuite, elles ont été cultivées avec un facteur biologique qui favorise leur division. Trois jours plus tard, un gène d'intérêt préalablement mis au point a été introduit dans les cellules à l'aide d'un rétrovirus. Elles ont finalement été réinjectées dans l'enfant par intraveineuse. L'apparition dans le sang des premiers lymphocytes T a nécessité un temps variant de 1 à 3 mois, selon le sujet. À l'heure actuelle, on ignore par contre si le traitement est définitif ou s'il faudra recommencer dans quelques années.
Traiter le cancer
Aujourd'hui, 60% des essais cliniques de thérapie génique concernent le cancer. Ici, il ne s'agit pas restituer les fonctions déficientes des cellules, mais plutôt de détruire celles qui se multiplient de façon anarchique. Pour ce faire, on peut introduire un gène qui favorise la réponse immunitaire face aux cellules défectueuses. On parle ici d'immunothérapie. Par exemple on peut favoriser la production de lymphocytes T et optimiser la sécrétion de cytokine. Il existe comme ça de nombreux scénarios mais très peu ( sinon aucun ) n'a donné de résultat concluant.
Une seconde approche consiste à introduire un " gène suicide " à l'intérieur des tumeurs. Ce gène code pour la production d'une protéine et d'une enzyme qui, combinées, sont délétères pour la cellule infectée. Le système suicide le plus connu et le plus étudié est celui du gène de la thymidine kinase de l'herpès virus. En gros, ce gène bloque la réplication cellulaire. Le métabolite toxique à également la caractéristique de se répandre dans les cellules voisines.
Lorsqu'il s'agit d'insérer un gène toxique, il est important de n'affecter que les cellules cancéreuses. L'utilisation d'un rétrovirus est pertinente puisque ce type de vecteur ne transfère son matériel génétique que dans les cellules en division. Une autre méthode consiste à insérer un gène qui ne s'exprimera que dans les cellules cancéreuses en plaçant ce dernier sous le contrôle transcriptionnel de régions régulatrices de la transcription spécifique des cellules tumorales hépatiques. Ici encore, l'approche thérapeutique à l'aide de gène suicide n'en est encore qu'à l'expérimentation
Un vecteur de transfert de gène est un agent biologique capable d'apporter un ou des gènes à un endroit voulu dans une cellule. Pour être efficace, un vecteur doit posséder certaines caractéristiques, qui dépendent en fait de l'usage que l'on veut en faire. Les vecteurs naturels qui sont couramment utilisés sont les virus. Ceux-ci ont en effet la capacité d'insérer naturellement leur génome dans la cellule cible. En ce qui à trait aux vecteurs artificiels, ils doivent également pouvoir traverser la membrane plasmique de la cellule dans le but que le gène transporté puisse s'y exprimer. Après endocytose, les vecteurs actuels se retrouvent dans des vésicules intracellulaires. Le contenu de ces endosomes aboutit normalement dans les lysosomes où il est digéré. Le vecteur doit donc pouvoir sortir de l'endosome avant d'être désintégré par un lysosome. Ensuite, les gènes transportés doivent atteindre le noyau, lieu habituel de leur expression. Pendant la division cellulaire, il n'y a aucun problème puisque l'enveloppe nucléaire est dissoute. Par contre, comme la majorité des cellules sont au repos, cette enveloppe constitue une barrière qui ne laisse passer, par diffusion, que des molécules inférieures à 9 nm. Les molécules plus grosses ( jusqu'à 25 nm ) peuvent emprunter les pores nucléaires mais doivent par contre posséder une sorte de " signal de reconnaissance. "
Le rétrovirus est un virus dont le matériel génétique est de l'ARN qui est transcrit en ADN par la transcription inverse. Il transmet son génome à la cellule hôte lors de la division cellulaire. Les premiers vecteurs disponibles ont été les vecteurs rétroviraux et aujourd'hui, ce sont les plus utilisés. De façon naturelle, le rétrovirus intègre son génome à celui de la cellule. L'intégration chromosomique permet une expression stable et permanente des gènes insérés. Le fait qu'il ne puisse infecter que des cellules en phase de division est un avantage pour le traitement de cellules tumorales puisqu'il ne s'attaquera pas aux cellules saines. Si l'on souhaite introduire un gène particulier dans une cellule normale, il faut enclencher le mécanisme de la division cellulaire. Pour cela, il suffit de cultiver les cellules ex vivo.
Le vecteur rétroviral n'est par contre pas parfait. Il ne peut transporter qu'un nombre très limité de gènes et étant donné qu'on ne peut contrôler l'insertion, les risques de mauvaises mutations sont élevés. De plus, il est laborieux de produire ce type de vecteurs à grande échelle. Ici encore, on n'en est qu'au stade de l'expérimentation. Un équipe de chercheur américain a prouvé que le traitement d'une maladie héréditaire ( l'hypercholestérolémie, 1992 à 1996 ) à l'aide de rétrovirus était possible mais, pour le moment, loin d'être très efficace. Certains patients ont connu une faible amélioration de leur état de santé, sans toutefois être guéri. Néanmoins, il fut également prouvé que la thérapie ne comporte aucun effet secondaire non souhaité.
L'adénovirus est un virus dont le matériel génétique est un double brin d'ADN qu'il peut transmettre à n'importe quel type de cellules, qu'elles soient au repos ou en mitose. Sa capacité de transport est 8 fois supérieure à celle des rétrovirus. Ses gènes ne s'intègrent pas au chromosome ( ils demeurent sous forme d'épisomes ) et ont donc tendance à disparaître au cours des divisions cellulaires. Il est très approprié pour les traitements in vivo et l'expression des gènes insérés a réussi dans pratiquement 100% des essais effectués. Malheureusement pour les thérapeutes géniques, l'expression des gènes est très limitée dans le temps. ( Environ 15 jours. ) De plus, il provoque de fortes réactions immunitaires excluant la pratique d'injections régulières. Par contre, les recherches s'orientent dans le but de désactivé la partie du virus qui provoque un tel rejet et celles-ci sont très prometteuses.
Le virus adéno-associé est un petit virus à ADN linéaire simple brin. Pour se répliquer, il a besoin d'un virus auxiliaire tel l'adénovirus ou encore le virus de l'herpès. Plusieurs propriétés intéressantes en font un bon vecteur potentiel. Outre son innocuité, il peut infecter presque tous les types de cellules et ce peu importe leur étape de développement. Il possède également une très grande résistance aux conditions extrêmes ( pH, température ) ce qui en facilite la manipulation. Bien que le système immunitaire ne réagisse pas face à l'introduction d'un AAV, les humeurs corporelles ( liquides organiques ), elles, répondent à l'administration de cet intrus sans toutefois lui être nuisible. Par contre, l'efficacité des injections subséquentes s'en trouve altérée.
Un liposome est un vecteur synthétique. Grossièrement, il s'agit d'une micro gouttelette graisseuse contenant une molécule d'ADN et capable de traverser la membrane cellulaire. L'ADN est un polymère chargé négativement. Or, la membrane cellulaire est également composée de molécules anioniques. Pour que la bulle contenant l'ADN puisse traverser sans encombre la membrane plasmique, il lui faut être compactée par un agrégat de charges positives telles les histones. Cette macromolécule est intégrée à la cellule par endocytose et se retrouve piégée dans un endosome. Une fois à l'intérieur de la cellule, le liposome doit sortir de l'endosome pour éviter d'être attaqué par un lysosome et pour pouvoir atteindre le noyau. Ce type de vecteur synthétique est très facile à produire et propose une réaction immunitaire quasi nulle. Par contre, le traitement n'est effectif qu'en mode ex vivo et l'expression du gène inséré n'est que d'une très courte durée. De plus, un problème d'efficacité s'impose : il faut insérer en moyenne 100 000 molécules d'ADN par cellule cible pour qu'une seule séquence ne parvienne au noyau. À ce niveau, on peut craindre un problème de toxicité.
Un chromosome artificiel est un chromosome fonctionnel auquel on a retiré le matériel génétique original pour le remplacer par une série de gènes visant à répondre à un besoin précis. Cette idée ne date pas d'hier. Le premier chromosome artificiel a avoir été fabriqué est celui d'une levure en 1980. La création du premier chromosome artificiel humain a été annoncée en avril 1997, après 10 ans de travaux acharnés. Reproduire quelque chose d'aussi complexe qu'un chromosome humain n'est pas chose facile puisqu'il s'agit en fait de recréer en laboratoire ce qui est à la base de la vie.
Bien qu'aujourd'hui ce soit le domaine dans lequel il a le plus d'avenir, l'idée du chromosome artificiel n'est pas née dans le but de servir à la thérapie génique. Ce n'est que plus tard que l'on proposa cela. Au début, on prévoyait s'en servir pour mieux comprendre le principe de la ségrégation des allèles. On espérait également en apprendre plus sur l'influence probable de l'environnement génétique sur l'activité chromosomale.
Mais, rapidement, l'idée d'utiliser cette nouvelle technologie en thérapie génique s'est imposée. Et avec raison. Le chromosome artificiel présente des avantages considérables par rapport aux vecteurs viraux traditionnels ( très risqués et peu efficaces ) décrits antérieurement, tellement qu'il pourrait même jusqu'à devenir une solution de rechange définitive. Tout d'abord, il ne s'intègre pas au génome mais son expression est quand même permanente. Une fois à l'intérieur de la cellule, le chromosome artificiel se comporte comme ses semblables et se réplique de façon indépendante lors de la mitose. Il est ainsi entraîné dans chacune des cellules filles, alors que les gènes insérés selon les méthodes classiques se perdent souvent lors de la division cellulaire ( processus constant dans l'organisme. ) Le fait qu'il ne fusionne pas avec un des chromosomes déjà présents est également une caractéristique intéressante puisque cela rend pratiquement nul les risques de mutations liés à une mauvaise insertion. De plus, le chromosome artificiel possède l'avantage d'être beaucoup, beaucoup plus gros que ses confrères vectoriels. Alors que les meilleurs vecteurs ne peuvent transporter que quelques dizaines de kilobases, un chromosome, même très petit, peu transporter plusieurs centaines ( voire milliers ) de mégabases. Finalement, le chromosome artificiel n'est aucunement attaqué par le système immunitaire. On comprend donc aisément pourquoi les génothérapeutes sont si enthousiasme par rapport à cette nouvelle technologie.
L'art de fabriquer un chromosome artificiel consiste en une série d'étapes très laborieuses. Un chromosome ( normal ) se constitue de trois éléments principaux. Aux l'extrémités se trouvent les télomères. Le télomère est une courte séquence d'ADN qui se réplique continuellement et qui, en quelque sorte, sert d'indicateur de vieillesse à la cellule. Puis, il y a une petite zone où se trouvent les gènes qui initialisent la réplication du chromosome lorsque la cellule se divise. Elle ne porte pas de nom bien précis. Finalement, on trouve, au centre de chaque chromosome, le mystérieux mais essentiel centromère qui joue un rôle vital dans le processus de division cellulaire. De ces faits, voici ce que les chercheurs ont conclu : Si l'on peut synthétiser ces composants essentiels et qu'on les injecte dans une cellule, celle-ci les assemblera ( les réparera ) en un tout fonctionnel et ce, peu importe les gènes qui y auront été insérés.
La fabrication du chromosome de levure n'a causé aucun problème. Par contre, les scientifiques se sont arraché les cheveux en tentant la même chose pour un chromosome humain. La synthèse des télomères et de " l'origine de la réplication " n'a pas été difficile. Le réel problème reposait sur le centromère. Le centromère, et les dizaines de mégabases qui le constituent, est la zone la moins connue du chromosome. Les chercheurs ont tenté de les étudier plus minutieusement, mais ils ont été confus de s'apercevoir que la taille du centromère varie d'un chromosome à l'autre. À partir de là, ils n'y sont pas allés par quatre chemins.
La méthode utilisée à ce jour pour fabriquer un chromosome artificiel est radicale. On prend un vrai chromosome, on lui retire ses constituants non essentiels et on les remplace par les gènes que l'on veut introduire dans la cellule. Pour insérer le chromosome dans celle-ci, on se sert d'une mince aiguille. Une fois à l'intérieur, la cellule reconnaît l'intrus comme étant l'un de ses propres chromosomes ... qui est un peu abîmé. Elle s'empresse donc de le réparer ( de l'assembler ) et ce dernier rejoint rapidement ses semblables.
La première expérience effectuée sur les chromosomes artificiels, en avril 1997, a montré que ceux-ci pouvaient survivre en culture pendant six mois ( durée de l'expérience ) tout en ce transmettant d'une cellule à l'autre lors de la division cellulaire. De là, il a fallu patienter deux ans avant que les essais sur des animaux ne soient satisfaisants. Une souris a finalement accepté et transmis à ses descendants un chromosome artificiel. En juillet 2000, la compagnie canadienne Chromos Molecular Systems Inc. a annoncé avoir réussi à transmettre un chromosome artificiel fonctionnel sur trois générations de souris, sans conséquence apparente pour les cobayes. Le chromosome ne comportait par contre aucun gène thérapeutique. Il transportait simplement un colorant qui permettait de le suivre dans son évolution. Mais rien n'indique que l'expérience aurait échoué si l'on aurait insérer de " vrais " gènes.
La compagnie se retient dans ses déclarations, puisqu'elle est consciente que le fait d'avoir accompli une telle chose sur des souris ouvre la porte pour des traitements semblables chez l'humain. Elle promet que ce n'est pas dans ses intentions. Avant d'en arrivée à ce succès, des centaines d'animaux ont été " gaspillés " et beaucoup d'échecs sont survenus. À ce jour, la firme prévoit utilisé cette technique pour créer des animaux producteurs de lait médicamenteux. La technologie des chromosomes artificiels est beaucoup plus fiable, plus simple, moins risqué et permet de transporter beaucoup plus de gènes. Elle est donc, sur tous les points, beaucoup plus rentable que la vectorologie.
Malgré ce que les compagnies en disent, le pied est déjà dans la porte pour les manipulations sur l'humain. On prévoit que, dans moins de dix ans, il sera possible ( techniquement du moins ) de modifier la lignée germinale humaine, une pratique qui en effraie plus d'un. Se poseront alors des questions du genre : Est-ce qu'un enfant modifié ( « amélioré » ) n'aurait pas eu le droit d'avoir un génome non altéré ? Une réponse est déjà anticipée. Les gènes insérés demeureront inactifs jusqu'à ce que la personne les actives volontairement.
Les manipulations génétiques provoquent, depuis les toutes premières expériences, d'énormes débats opposants les grands visionnaires aux fervents protecteurs de la vie. Pourtant, certains diront que nous n'avons pas fait grand chose jusqu'à présent. La transgenèse traditionnelle n'est, en fait, que l'expression différente de quelque chose qui était sensée fonctionner autrement. Mais quand on parle de créer un chromosome au complet, on parle de jouer avec le constituant le plus fondamental de la vie. Les comités d'éthique réagissent très mal à cela ...
Trepy, Décembre 2001